| 发布时间：2006-11-30 信息来源：农业部渔业局综合处 |
| 今年以来，水产业出现了三件影响甚大的事件，如果说"福寿螺"与"大闸蟹"事件还没有引起人们对整个水产行业重视的话，那么11月17日发生在上海的"多宝鱼"事件则真正给水产行业敲响了警钟。 11月27日，农业部公布了有关上海"多宝鱼"事件的调查处理情况，渔业部门同时要求有关企业一律停止药残超标的多宝鱼上市销售，直到所有产品检验合格。以前几十元钱一斤，现在两三块钱也没有人要，多宝鱼市场有20多个亿的产值，这一产业的背后牵动着众多企业与渔民的生计，不能把多宝鱼一棒子打死。21世纪是海洋的世纪，人们未来的食品很多要从海洋中获取,如何避免类似事件的发生,是我们不得不面对的问题。 要从根上解决安全问题，首先是水产养殖方式的转变。工厂化养殖、虾池养殖、鱼排养殖等是大多数养殖企业与养殖户采取的养殖方式，一般是在近海通过设施的方式进行，和现在一些企业进行底播增殖、人工放流有很大差距，养殖方式有一定的缺陷性。国家应鼓励底播增殖、人工放流这种生态、自然的放养方式，鼓励企业与养殖户向这种方式转变。 其次是解决苗种的问题。农业部在全国各地建立了为数不少的原良种场，但是远远满足不了养殖企业与养殖户发展的需要。因为原良种质量不高，导致苗种抗病性差，养殖户在养殖过程中必须投药物，才能保证苗种的安全。因此，要建立健全相关制度，严厉打击水产行业的假冒伪劣种苗。 第三是解决用药的问题。水产养殖与种植业一样，也要用药。种植业是用化肥，而水产养殖保苗也要用药。近年来，在种植业上有机肥、绿色肥等层出不穷，农民选择的余地也很大。而水产养殖方面符合环保、对人类无害的生物药物却很少，甚至是空白，养殖户没有可用的药。为了保苗，总不能眼睁睁地看着精心养殖的水产品因无药而死亡，所以一些养殖户无可奈何之下就用了禁药。因此需要国家大力扶持科研单位研发疫苗生物制剂药物，替代有害的药物。 第四是解决产品检测问题。现在我国水产品检测手段比较滞后，比如大连的养殖企业与养殖户要把检测的产品送到青岛去检测。政府部门应该在养殖集中的区域建立一批检验、检测机构，也可以更好地发挥科研队伍、龙头企业作用，在有能力的龙头企业建立质检中心，这样建立起一批中小型检验机构，能就近为养殖户提供方便的服务，并定期或不定期地对养殖户进行全面检查，只有这样，才能及时发现问题，不至于让有害水产品流入市场。 第五是发挥行业协会的作用。中国渔业协会副会长、大连海参商会会长吴厚刚说，"多宝鱼"事件暴露出渔业发展中的软肋。从政府角度来讲要把更多责任放给行业协会，鼓励行业协会自律，在协会内建立用药、养殖标准，如果大家都能遵守这个规范，把不遵守规范的企业个人边缘化，发挥行业协会与龙头企业的作用，就会有效避免类似问题的发生。 |
2006年11月30日星期四
农民日报："多宝鱼"事件给水产行业敲响警钟
2006年11月29日星期三
青岛水族馆将闭馆半年 修缮后开放-中国金鱼专业网
| 青岛水族馆将闭馆半年 修缮后开放 | |
| 作者: 时间: 2006-11-24 10:44:00 来源: 生活日报 | |
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《植物生态学报》部分编委座谈会于2006年1月9日在北京召开(中国科学院植物研究所)
| 《植物生态学报》目前无论是在学术界还是期刊界均有较高的声誉，刊物已被国际众多检索数据库(CA、BA、AJ、ISI中Biologydata、AGRIS等)收录，目前该刊在CAJCED(中国学术期刊评价数据库)影响因子为2.733,在生命类期刊中排名第一;在CSTPCD(中国科技论文与引文数据库)影响因子为1.373,在这两个数据库中该刊期刊他引率,即《植物生态学报》被其他期刊引用的比率高达94%,远远高于我国期刊他引率的平均值(60%)。同时该刊被国际SCI刊物引用近400次，并被国际知名刊物NATURE引用3次。《植物生态学报》得到了中国科学院优秀学术期刊和中国科协高技术重点学术期刊的资助。 |
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
| 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 | ||
| 作者：bioguide 更新时间：2003-11-21 | ||
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蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、实验目的
1． 了解电泳实验原理
2． 掌握电泳实验操作规程
3． 用电泳方法测定蛋白分子量
二、实验原理
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964) 和Davis(1964) 设计的, 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含Tris-HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域, 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。
SDS与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形状的长椭园棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样（约为18Å， 即1.8nm），而长轴则随蛋白质分子量成正比地变化。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭园棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此测定的结果只是亚基或单条肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离笵围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 "双丙烯酰胺～丙烯酰胺" 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按"双丙烯酰胺～丙烯酰胺"为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%） 线性分离范围（kD）
15 12～43 10 16～68 7.5 36～94 5.0 57～212
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
三、实验材料和试剂
1． 试剂
（1）丙烯酰胺和N, N'-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙烯酰胺和1%（w/v）N, N'-亚甲双丙烯酰胺的贮存液，丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化的， 故应核实溶液的pH值不超过7.0。这一溶液置棕色瓶中贮存于室温，每隔几个月须重新配制。
小心：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤。
（2） 十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS可用去离子水配成10%（w/v）贮存液保存于室温。
（3）用于制备分离胶和积层胶的Tris缓冲液。
（4）TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
（5）过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。须新鲜配制。
（6）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液）
（7）1M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液）
（8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
25mM Tris
250mM 甘氨酸 (pH 8.3)
0.1% SDS
(9) 样品处理液
50mM Tris-HCl(pH 6.8)
100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)
2% SDS
0.1% 溴酚蓝
10%甘油
（10）染色液：
0.1% 考马斯亮蓝 R250
40% 甲醇
10% 冰醋酸
(11）脱色液：
10% 甲醇
10% 冰醋酸
四、实验步骤
1. 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂
2．SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 （realplay）
⑴ 根据厂家说明书安装玻璃板。
⑵ 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
| 溶液成分 | 总体积 5ml | 总体积 10ml | 总体积 15ml | 总体积 20ml | 总体积 25ml | 总体积 30ml |
| 6% |
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| 水 | 2.6ml | 5.3ml | 7.9ml | 10.6ml | 13.2ml | 15.9ml |
| 30% 丙烯酰胺 | 1.0ml | 2.0ml | 3.0ml | 4.0ml | 5.0ml | 6.0ml |
| 1.5M Tris(pH 8.8) | 1.3ml | 2.5ml | 3.8ml | 5.0ml | 6.3ml | 7.5ml |
| 10% SDS | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| 10% 过硫酸胺 | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| TEMED | 0.004ml | 0.008ml | 0.012ml | 0.016ml | 0.02ml | 0.024ml |
| 8% |
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| 水 | 2.3ml | 4.6ml | 6.9ml | 9.3ml | 11.5ml | 13.9ml |
| 30% 丙烯酰胺 | 1.3ml | 2.7ml | 4.0ml | 5.3ml | 6.7ml | 8.0ml |
| 1.5M Tris(pH 8.8) | 1.3ml | 2.5ml | 3.8ml | 5.0ml | 6.3ml | 7.5ml |
| 10% SDS | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| 10% 过硫酸胺 | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| TEMED | 0.003ml | 0.006ml | 0.009ml | 0.012ml | 0.015ml | 0.018ml |
| 10% |
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| 水 | 1.9ml | 4.0ml | 5.9ml | 7.9ml | 9.9ml | 11.9ml |
| 30% 丙烯酰胺 | 1.7ml | 3.3ml | 5.0ml | 6.7ml | 8.3ml | 10.0ml |
| 1.5M Tris(pH 8.8) | 1.3ml | 2.5ml | 3.8ml | 5.0ml | 6.3ml | 7.5ml |
| 10% SDS | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| 10% 过硫酸胺 | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| TEMED | 0.002ml | 0.004ml | 0.006ml | 0.008ml | 0.01ml | 0.012ml |
| 12% |
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| 水 | 1.6ml | 3.3ml | 4.9ml | 6.6ml | 8.2ml | 9.9ml |
| 30% 丙烯酰胺 | 2.0ml | 4.0ml | 6.0ml | 8.0ml | 10.0ml | 12.0ml |
| 1.5M Tris(pH 8.8) | 1.3ml | 2.5ml | 3.8ml | 5.0ml | 6.3ml | 7.5ml |
| 10% SDS | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| 10% 过硫酸胺 | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| TEMED | 0.002ml | 0.004ml | 0.006ml | 0.008ml | 0.01ml | 0.012ml |
| 15% |
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| 水 | 1.1ml | 2.3ml | 3.4ml | 4.6ml | 5.7ml | 6.9ml |
| 30% 丙烯酰胺 | 2.5ml | 5.0ml | 7.5ml | 10.0ml | 12.5ml | 15.0ml |
| 1.5M Tris(pH 8.8) | 1.3ml | 2.5ml | 3.8ml | 5.0ml | 6.3ml | 7.5ml |
| 10% SDS | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| 10% 过硫酸胺 | 0.05ml | 0.1ml | 0.15ml | 0.2ml | 0.25ml | 0.3ml |
| TEMED | 0.002ml | 0.004ml | 0.006ml | 0.008ml | 0.01ml | 0.012ml |
⑶ 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间( 梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。
⑷ 分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。
⑸ 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。
配制 Tris- 甘氨酸 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 5% 浓缩胶溶液
| 溶液成分 | 总体积 3ml | 总体积 4ml | 总体积 5ml | 总体积 6ml | 总体积 8ml |
| 水 | 2.1ml | 2.7ml | 3.4ml | 4.1ml | 5.5ml |
| 30% 丙烯酰胺 | 0.5ml | 0.67ml | 0.83ml | 1.0ml | 1.3ml |
| 1M Tris(pH 6.8) | 0.38ml | 0.5ml | 0.63ml | 0.75ml | 1.0ml |
| 10% SDS | 0.03ml | 0.04ml | 0.05ml | 0.06ml | 0.08ml |
| 10% 过硫酸胺 | 0.03ml | 0.04ml | 0.05ml | 0.06ml | 0.08ml |
| TEMED | 0.003ml | 0.004ml | 0.005ml | 0.006ml | 0.008ml |
⑹聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。
⑺在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液，在100℃加热3分钟以使蛋白质变性。
⑻ 浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。
⑼ 按予定顺序加样，加样量通常为10～25μl（1.5mm厚的胶） 。
⑽ 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。
⑾ 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。
3．用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺凝胶进行染色
经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色1～2小时或过夜。
4. 换脱色液脱色，需3～10小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。
此方法检测灵敏度为0.2～1.0 mg。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。
五、结果处理
测量并计算分子量
蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式：
Mw ＝ K (10－bm) (1)
lgMw = lg K －bm = K1－bm (2)
其中Mw是蛋白质分子量；K和K1为常数
b为斜率，m 是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。
如果用几种标准蛋白质分子量的对数作纵坐标，用各自的相对迁移率作横坐标，即可画出一条斜率为负的标准曲线。相对迁移率为：
其中，dpr、dBPB分别为样品和BPB（溴酚兰）以分离胶表面为起点迁移的距离。
欲求未知蛋白的分子量，只需求出它的相对迁移率：
mR未= dpr未/ dBPB
然后，从标准曲线上就可求出此未知蛋白的分子量。
取出脱色后的凝胶平放在两块透明投影胶片中间，赶尽气泡，在复印机上复印。在复印的凝胶图上用直尺分别量出各条蛋白带迁移的距离dpr和dBPB（以蛋白带的上沿或中心为准），计算相对迁移率，根据方程式：
lgMw = K1－bmR
用各标准蛋白分子量的对数（纵坐标）和相对迁移率mR（横坐标）画出标准曲线，由标准曲线再求出其他各条待测和未知蛋白带的分子量，如有可能计算其误差。